不同冷變形量高氮不銹鋼生物相容性研究
利用大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞比較不同冷變形量高氮不銹鋼的生物相容性差異。選取拉伸率分別為0、14%、34%、64%的高氮不銹鋼分別設(shè)為A、B、C、D組,通過細(xì)胞粘附性實驗、MTT檢測及堿性磷酸酶活性分析比較其生物相容性的不同。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著冷變形量的不斷增加,其生物相容性也在不斷地提高,表面細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及吸光度逐漸增大,細(xì)胞生長狀態(tài)良好。結(jié)論高氮不銹鋼的生物相容性隨著冷變形量的增加而增加。
修復(fù)由外傷、腫瘤、畸形修復(fù)等導(dǎo)致的骨組織缺損是臨床工作中面臨的巨大問題。常規(guī)修復(fù)分為自體移植修復(fù)和生物材料替代等,自體移植由于自體組織有限,移植操作難度大,手術(shù)費用高,且增加新的創(chuàng)傷,患者精神、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大。隨著材料學(xué)發(fā)展,生物材料替代是近年來興起的一種修復(fù)方法。生物材料替代是利用金屬或非金屬材料替代缺失組織,這類材料需要有較高的生物相容性,以鈦、鈦合金較為常見。但鈦、鈦合金等價格高昂,加工不易,所以研發(fā)一種價格便宜、容易加工的材料是材料學(xué)的研究方向。傳統(tǒng)的不銹鋼合金含鎳,易致畸、致敏。研制一種機(jī)械性能良好且不含鎳的不銹鋼極為重要。無鎳不銹鋼用氮和鎂替代鎳,即高氮鋼,其擁有良好的抗腐蝕性、機(jī)械性能及生物相容性。隨著氮含量的增加,高氮鋼的生物相容性增加。材料的親水性對細(xì)胞在其表面粘附和生長起到關(guān)鍵作用。材料內(nèi)的氮元素含量影響材料的親水特性。隨著氮含量增加,高氮鋼的生物相容性增加。冷變形的拉伸可改變材料表面親水性。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于機(jī)體內(nèi),由于最早于骨髓中得到分離,常被稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。本研究利用大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞探討不同冷變形量的高氮不銹鋼的生物相容性差異。
一、材料與方法
實驗材料為中國科學(xué)院金屬研究所提供的不同冷變形量的高氮不銹鋼,拉伸率分別為0、14%、34%、64%,分別設(shè)為A、B、C、D組。經(jīng)高溫固溶、切片、拋光,制作成10mm×10mm×1mm的薄片,清洗消毒后備用。
二、研究方法
1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴(kuò)增
將4周齡的大鼠(雌雄不限)脫頸處死后,無菌分離雙側(cè)股骨,去除軟組織,剪斷骨端,10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10ml沖洗骨髓腔。收集沖洗后液體,置于培養(yǎng)瓶中,2天后首次換液,連續(xù)培養(yǎng)時,每隔4天換液,每7天傳代。培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗;培養(yǎng)條件37℃,濕度100%,5%CO2。傳代比例為1∶6。連續(xù)擴(kuò)增細(xì)胞備用。
2.高氮不銹鋼表面細(xì)胞培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)
將預(yù)先消毒處理好的不同冷變形比例的高氮不銹鋼片放入24孔板,每種冷變形比例的高氮鋼片設(shè)3個復(fù)孔,將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為1×104個/ml,以模仿人體的成骨微環(huán)境。在每個材料表面及空白孔內(nèi)滴加1 ml細(xì)胞懸液。培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗。培養(yǎng)條件:37℃,濕度100%,5%CO2。連續(xù)培養(yǎng)。
3.細(xì)胞粘附
將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞接種于不同冷變形比例的高氮鋼片表面,12小時后輕輕去掉培養(yǎng)液,胰蛋白酶消化,細(xì)胞計數(shù)。將粘附細(xì)胞量除以種植細(xì)胞量以獲得細(xì)胞在不同金屬片表面的粘附率。
4.MTT實驗
稱取0.5g MTT,溶于100ml的磷酸緩沖鹽溶液中,針頭濾器過濾除菌,置于4℃避光保存。在配制和保存的過程中,容器用鋁箔紙包住。通過MTT實驗對不同冷變形高氮鋼表面粘附細(xì)胞活性進(jìn)行檢測,由于一部分粘附于金屬材料表面的細(xì)胞已死亡,為精確確定金屬表面活細(xì)胞的數(shù)目和細(xì)胞活力而進(jìn)行MTT細(xì)胞活性檢測。將在金屬表面培養(yǎng)的第1、3、5 天的細(xì)胞按試劑盒的方法進(jìn)行MTT檢測。
5.觀察材料表面細(xì)胞形態(tài)
在金屬片接種細(xì)胞的第1、3、5天分別按組取出金屬片,PBS沖洗,2.5%戊二醛固定,50%、75%、95%、100%乙醇梯度脫水,金相顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)。
6.堿性磷酸酶檢測實驗
分別將種植于材料表面的細(xì)胞培養(yǎng)至第1、3、5天,取出用PBS輕輕沖洗3遍,在4℃環(huán)境下用0.01%TritonX-100裂解細(xì)胞12小時,然后用吸管反復(fù)吹打1分鐘,使細(xì)胞充分碎解。按照試劑盒的說明進(jìn)行檢測,堿性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏單位表示,結(jié)果以3次獨立實驗的平均值表示。
二、材料表面細(xì)胞粘附率及細(xì)胞形態(tài)
A、B、C、D組高氮不銹鋼表面細(xì)胞粘附率分別為88%、90%、93%、94%。隨著冷變形率的提升,材料表面粘附的細(xì)胞數(shù)量提升,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。將基質(zhì)干細(xì)胞種植于材料表面培養(yǎng)1、3、5天后,在金相顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞在材料表面生長良好并發(fā)生增殖。比較第1天各組金屬表面的細(xì)胞光密度值,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第3、5天,隨不同冷變形率高氮鋼與細(xì)胞接觸作用時間的延長,吸光度逐漸增大,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,各種冷變形率的高氮鋼均對基質(zhì)干細(xì)胞沒有破壞和抑制生長作用,組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第1天,4種金屬表面的細(xì)胞堿性磷酸酶活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在第3、5天時,隨著冷變形率的增高,高氮鋼表面的細(xì)胞堿性磷酸酶活性增高,組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
各種原因引起的骨缺損是臨床常見的癥狀,由于骨缺損而引起的軟組織塌陷和相關(guān)功能障礙是臨床中的常見問題。生物醫(yī)用金屬材料由于高硬度的力學(xué)性能及耐腐蝕性被廣泛應(yīng)用,以鈦、鈦合金及醫(yī)用奧氏體不銹鋼較為常見。奧氏體不銹鋼含有鎳,鎳原子對細(xì)胞的直接損害及長期致畸作用已被證實。性能良好且不含鎳的生物醫(yī)用金屬材料對骨缺損患者極為重要。生物醫(yī)用金屬材料植入骨組織的過程中,不可避免的會造成骨組織損傷。早期機(jī)械性固位時,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在骨修復(fù)開始時會從組織中游出,并向損傷處聚集,在各種生物因子的作用下,產(chǎn)生成骨性分化,首先分化為成骨前體細(xì)胞,最終變?yōu)楣羌?xì)胞。骨基質(zhì)將植入材料和骨組織結(jié)合,最終完成生物性固位。在此過程中,處于正常骨組織和植入材料之間的基質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、活性、增殖性及成骨分化能力對于植入材料的后期穩(wěn)定性和生物相容性起著重要作用。本研究中,基質(zhì)干細(xì)胞作為檢測不同冷變形量的高氮不銹鋼的生物相容性的種子細(xì)胞,將其接種于不同冷變形量的高氮不銹鋼表面12小時后發(fā)現(xiàn),隨著冷變形量的增加,其細(xì)胞粘附率同時增加,這可能于冷變形量增大提高材料表面的親水性有關(guān)。作為生物材料此結(jié)果意味著在材料植入機(jī)體后,初期冷變形量大的高氮鋼周圍可以聚集更多的基質(zhì)干細(xì)胞。MTT檢測法可有效區(qū)分細(xì)胞群中的活性細(xì)胞。實驗結(jié)果證明,隨著冷變形量的增加,高氮鋼表面的細(xì)胞活性隨之增加。堿性磷酸酶活性可檢測基質(zhì)干細(xì)胞在材料表面的成骨能力,其結(jié)論為隨著冷變形量的增加,高氮不銹鋼表面的細(xì)胞堿性磷酸酶活性隨之增加。同時,通過金相顯微鏡直觀觀察整個細(xì)胞培養(yǎng)過程中高冷變形量的高氮鋼表面的細(xì)胞密度更高。綜上所述,隨著冷變形率的提高,高氮鋼的生物相容性提高。但加工冷變形會對高氮不銹鋼的力學(xué)性能產(chǎn)生影響,而植入材料不僅要具有良好的生物相容性,還需具有良好的機(jī)械性,今后仍需進(jìn)一步研究。
本文標(biāo)簽:高氮不銹鋼
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